第二节药品质量检验与体内药物检测

知识点一、药品检验程序与项目

知识点二、药品质量检验

知识点三、体内药物检测

知识点一、药品检验程序与项目

大纲要求：

1.取样

2.性状

3.鉴别

4.检查

5.含量与效价测定

6.微生物限度检查

药品检验工作的基本程序有取样、检验和出具检验报告等环节。在检验环节，检验的项目包括：性状（物理常数）、鉴别、检查、含量或效价测定。

（一）取样

样品系指供检验用的来自同一批产品的有代表性的部分产品，取样则系指从一批产品中按一定规则抽取样品的过程。在取样之前，应先检查药品名称、批号、数量、包装等情况，符合要求后方可取样。

取样的件数因产品批量的不同而不同。设药品包装（如箱、桶、袋、盒等）总件数为n，当n≤3时，应每件取样；当3<n≤300时，取样的件数应为√n+1；当n>300时，按√n／2+10的件数取样。

所抽取的样品应真实并具有代表性，取样方法应具有科学性。除另有规定外，一般为多部位等量取样，混合后作为样品进行检验。一次取得的样品至少可供3次检验用。

取样时必须填写取样记录，取样容器和被取样包装上均应贴上标签。

（二）性状

药物的性状查验是药品质量检验工作的第一步。药物的性状包括外观与物理常数。外观系对药品的形态、色泽、嗅味等感官感知的物理属性的规定；物理常数则是药物固有的物理特性常数，是评价药品质量的主要客观指标之一，在此主要简介熔点和旋光度测定法。

1.外观

外观系根据药品标准规定对药品质量的初步感官评价。例如，《中国药典》制剂通则中片剂项下规定：片剂系指原料药物或与适宜的辅料制成的圆形或异形的片状固体制剂。片剂外观应完整光洁，色泽均匀，有适宜的硬度和耐磨性，以免包装、运输过程中发生磨损或破碎，

除另有规定外，非包衣片应符合片剂脆碎度检查法的要求。若片剂表面不完整或颜色不均匀，应视其破损或不均匀程度以及其他项目的检验结果综合判定是否合格。

2.物理常数测定法

(1)熔点测定法：熔点是多数固体药物需要测定的重要物理常数。测定熔点的药品，应是遇热晶型不转化，其初熔点和全熔点容易分辨的药品。

①测定方法：《中国药典》采用毛细管测定法，依照待测药物性质的不同，分为三种方法：第一法用于测定易粉碎的固体药品；第二法用于测定不易粉碎的固体药品，如脂肪、脂肪酸、石蜡、羊毛脂等；第三法用于测定凡士林或其他类似物质。当各品种项下未注明时，均系指第一法。

②应用：药物的熔点收载在质量标准中的“性状”项下。多数药物采用第一法测定，例如盐酸普鲁卡因的熔点为154℃～157℃；硫酸阿托品在120℃干燥4小时后，立即依法测定，熔点不得低于189℃，熔融同时分解；乙琥胺为白色至微黄色蜡状固体，其熔点用第三法测定为43℃~47℃（以液状石蜡为传温液）。

(2)旋光度测定法

①基本概念

旋光度：当平面偏振光通过含有某些光学活性物质（如具有不对称碳原子的化合物）的液体或溶液时，能引起偏振光的振动平面向左或向右旋转。偏振光旋转的度数称为旋光度(α)。

旋光度有右旋、左旋之分，偏振光向右旋转（顺时针方向）称为“右旋”，用符号“+”表示；偏振光向左旋转（逆时针方向）称为“左旋”，用符号“-”表示。

比旋度：偏振光透过长1dm，且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定波长与温度下，测得的旋光度称为比旋度，以表示。比旋度是旋光物质的重要物理常数，可以用来区别药物或检查药物的纯杂程度，也可用来测定含量。

物质的旋光度不仅与其化学结构有关，而且还和测定时溶液的浓度、光路长度以及测定时的温度和偏振光的波长有关。《中国药典》规定，除另有规定外，测定温度为20℃，测定管长度为1dm（如使用其他管长，应进行换算），使用钠光谱的d线(589.3nm)作光源，在此条件下测定的比旋度用表示。

②测定方法

将测定管用供试液体或固体药物的溶液（取固体供试品，按各药品项下的方法制成溶液）冲洗数次，缓缓注入供试液体或溶液适量（注意勿使产生气泡），置于读数至0.01并经过检定的旋光计内检测读数，即得供试液体或溶液的旋光度。用同法读取旋光度3次，取3次的平均数，计算供试品的比旋度或浓度。

③应用

药品的性状、检查、含量测定项下均有应用。具有旋光性的药物，在“性状”项下收载有“比旋度”。例如：肾上腺素、硫酸奎宁、葡萄糖、阿莫西林、氢化可的松等。肾上腺素比旋度的测定方法如下：取本品，精密称定，加盐酸溶液(9→200)溶解并定量稀释制成每1ml中含20mg的溶液，照“旋光度测定法”测定，比旋度为-50.0°～-53.5°。

（三）鉴别

鉴别是药品检验的主要内容之一，如前述药品的“性状”未发生显著改变时，则首先进行药品的鉴别。常用的药品鉴别方法有化学鉴别法、光谱鉴别法和色谱鉴别法。

1.化学鉴别法

根据药物的结构特征或特有官能团可与化学试剂发生颜色变化、产生沉淀、生成气体等具有显著特征的化学反应对药品进行鉴别。

(1)颜色反应：利用药物分子结构中的取代基与一定试剂反应，产生特定的颜色加以鉴别。同时，由于同类药物往往在不同位置上有不同取代基，遇到相同试剂，可产生不同色泽加以区别。

例如，具有游离酚羟基的对乙酰氨基酚，或经水解可生成含酚羟基的阿司匹林均可依据酚羟基与三氯化铁试液反应显紫堇色鉴别；具有芳伯氨基的芳香第一胺类药物，如磺胺甲噁唑的鉴别是在酸性条件下芳伯氨基与亚硝酸钠反应生成重氮盐，再与碱性β-萘酚缩合可生成橙黄色至猩红色的偶氮化合物；

具有氨基醇结构的盐酸麻黄碱可发生双缩脲反应，即在碱性条件下与硫酸铜形成蓝色配位化合物；含有莨菪酸结构的硫酸阿托品可发生托烷类生物碱的vitali反应，即与硝酸共热后在醇制氢氧化钾溶液中显深紫色；异喹啉类生物碱，吗啡与甲醛-硫酸试液反应（marquis反应）显紫堇色；维生素b₁，在碱性条件下与铁氰化钾反应生成具有蓝色荧光的硫色素。

又如，具有还原性的药物可使氧化剂还原并发生颜色改变，如司可巴比妥钠可使碘试液褪色，维生素c可使二氯靛酚钠试液褪色。

再如，均为苯乙胺类药物，含有一个酚羟基的去氧肾上腺素与三氯化铁试液反应显紫色；而具有邻二酚羟基结构的肾上腺素与三氯化铁试液反应则显翠绿色。

(2)沉淀反应：利用药物分子结构中的特定基团与一定试剂反应，生成特殊的沉淀鉴别药物。

例如，《中国药典》鉴别苯巴比妥的方法：取供试品约0.1g，加碳酸钠试液1ml与水10ml，振摇2分钟，滤过，滤液中逐滴加入硝酸银试液，即生成白色沉淀，振摇，沉淀即溶解；继续滴加过量的硝酸银试液，沉淀不再溶解。

(3)气体生成反应：利用药物分子结构中的特殊原子或基团，在一定条件下，如在酸性或碱性溶液中加热，能产生特殊的气体，以一定的方法检测。

例如，《中国药典》鉴别尼可刹米的方法：取本品10滴，加氢氧化钠试液3ml，加热，即发生二乙胺臭气，能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色。

(4)焰色反应：焰色反应是利用供试品在无色火焰中燃烧所显现的特征颜色鉴别药物的方法。本法适用于含钠(na)、钾(k)、钙(ca)、钡(ba)、锂(li)等金属离子的盐类药物的鉴别。

例如，《中国药典》鉴别钠盐的方法：取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显鲜黄色。依同法操作，钾盐显紫色；钙盐显砖红色；钡盐显黄绿色，通过绿色玻璃透视，火焰显蓝色。

2.光谱鉴别法

光谱鉴别法系利用电磁波与物质的作用进行鉴别的方法，通常采用分光光度法，通过测定药物的最大（或最小）吸收波长，或在最大（或最小）吸收波长处的吸光度（或透光率），对该药物进行鉴别。

分光光度法常用的波长范围中，200nm~400nm为紫外光区；400nm~760nm为可见光区：760nm~2500nm为近红外光区；2.5μm~25μm（按波数计为4000cm^-1~400cm^-1）为中红外光区。

在药物鉴别中，常用的分光光度法主要有紫外-可见分光光度法和红外分光光度法。

(1)紫外-可见分光光度法：利用紫外-可见吸收光谱进行鉴别的方法，称为紫外-可见分光光度法。紫外-可见吸收光谱包括紫外光区与可见光区，波长范围为200nm~760nm，用于药物鉴别的通常为紫外吸收光谱(200nm~400nm)。

紫外吸收光谱的纵坐标一般用吸光度表示，横坐标为紫外光的波长。图10-1为布洛芬的紫外吸收光谱。

例如，盐酸氯丙嗪用盐酸溶液(9→1000)制成每1ml含5μg的溶液，在254nm与306nm的波长处有最大吸收，在254nm的波长处吸光度约为0.46。

(2)红外分光光度法：利用红外吸收光谱对物质进行鉴别的方法称为红外分光光度法（ir）。药物的红外吸收光谱具有人指纹一样的特征专属性，常用于药物的鉴别。

红外吸收光谱与紫外-可见吸收光谱不同，其纵坐标一般用透光率(t%)表示；横坐标为红外光的波数(cm^-1)或波长（μm），一般用波数表示。红外吸收光谱中吸收峰通常为倒峰，吸收峰位是与透光率极小值对应的红外光波数。图10-2为盐酸普鲁卡因的红外吸收光谱。

红外吸收光谱图中常见的吸收峰按其所体现的结构特征信息可分为官能团区(4000cm^-1~1300cm^-1)和指纹区（1300cm^-1～400cm^-1）。

表10-2列出了典型化学基团的红外特征吸收峰（简称特征峰）。一个基团常有数种红外振动形式，其中能引起红外吸收的振动形式称为活性振动，故每种红外活性振动通常有一个相应的特征峰。这些与某一特定基团相应的一组（多个）特征峰，因该基团存在而存在，相互依存，又相互佐证，互称为相关峰。

3.色谱鉴别法

色谱法是一种物理分离分析方法，系将混合物中各组分分离后在线或离线分析的方法。色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、应用范围广等优点，是分析混合物的最有效手段。

色谱响应信号随时间的变化曲线称为流出曲线或色谱图（图10-3）。流出曲线上的突起部分称为色谱峰。正常色谱峰为正态分布曲线（呈对称形）。不正常色谱峰有两种：拖尾峰和前延峰。正常色谱峰与不正常色谱峰可用拖尾因子（或对称因子）来衡量。

 

(1)常用术语：色谱法常用术语如下：

保留时间(t_r)：从进样开始到组分色谱峰顶点的时间间隔称为该组分的保留时间，单位通常为分钟。

②半高峰宽(w_h/2)：峰高一半处的峰宽称为半高峰宽，与标准差σ（色谱峰上的拐点，即0.607倍峰高处至峰高垂线间的距离）的关系为：w_h/2=2.355σ。

③峰宽（w）：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽，或称基线宽度，w=4σ或w=1.699w_h/2。

④峰高(h)：组分色谱峰顶点至时间轴的垂直距离称为峰高，单位通常为毫伏(mv)。

⑤峰面积(a):组分色谱峰与基线围成的区域的面积称为峰面积，单位通常为毫伏·秒(mv·s)。

上述各项参数中，保留时间主要用于组分的鉴别；半高峰宽或峰宽主要用于色谱柱柱效的评价；峰高或峰面积主要用于组分的含量测定。

(2)常用方法：用于药物鉴别的色谱法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法。

①薄层色谱法：薄层色谱法(tlc)系将供试品溶液点样于涂布有固定相的薄层板上，经展开剂展开，将所得的色谱图与药物对照品按同法操作所得的色谱图进行比较的色谱分析法。

采用tlc鉴别时，将同浓度的供试品溶液与对照品溶液，在同一块薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显示主斑点的位置（rf）应与对照溶液的主斑点一致。

②高效液相色谱法：高效液相色谱法(hplc)，系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对已注入色谱柱的供试品进行分离测定的色谱方法。hplc是一种在线分离分析方法，具有分离效能高、应用范围广等特点。根据固定相与流动相极性的相对大小，基于分配机理的hplc分为正相色谱法与反相色谱法。

其中，流动相极性大于固定相极性的反相分配色谱法是应用最广泛的高效液相色谱法。

在含量测定采用hplc的品种项下，常利用色谱峰保留时间(t_r)进行鉴别。即在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

（四）检查

检查是在鉴别呈正反应后，顺次进行的检验项目。药品标准的检查项下，收载有反映药品的安全性与有效性的试验方法和限度、均一性与纯度等制备工艺要求等内容。其中，安全性、有效性与均一性的检查内容详见第一节药品标准与药典项下，此处主要阐述纯度检查的主要内容。

药物的纯度检查即为药物中的杂质检查，检查方法亦主要采用化学法、光谱法和色谱法。

1.化学分析法

化学分析法主要用于药物中的一般杂质的限量检查，主要检查法收载于《中国药典》通则项下，系利用药物中的杂质在规定溶剂中不溶或呈色，要求溶液澄清或无色；或与化学试剂反应生成浑浊或显色，再与规定限量的杂质对照依同法操作后进行比较，检查杂质的限量；或利用重量的改变进行检查。

例如，阿司匹林中“溶液的澄清度”检查，利用阿司匹林具有游离羧基显酸性，可溶于碳酸钠试液，而酯类杂质不溶于碳酸钠试液的特性，以温热的碳酸钠试液为溶剂，要求制成的溶液应澄清，以限制酯类不溶性杂质的量。

“重金属”检查，利用重金属杂质（以铅为代表）可在ph3.5的醋酸盐缓冲液中与显色剂硫代乙酰胺反应呈黄色至褐色的特性，供试品溶液经显色后与一定量铅标准液同法制成的对照液比较，要求供试品溶液所显的颜色不得更深，以限制重金属杂质的量。

“炽灼残渣”检查，将阿司匹林于700℃~800℃高温炽灼后，以残留的无机盐类的重量限制金属性杂质的量。

2.光谱分析法

对于在特定波长处具有显著吸收的特定有关物质（特殊杂质），如肾上腺素中的酮体、地蒽酚中二羟基蒽醌的检查，可采用紫外-可见分光光度法检查相关杂质；对于具有光学异构体的药物，如硫酸阿托品中的莨菪碱的检查可通过测定样品溶液的旋光度进行纯度检查。方法如下：

地蒽酚中二羟基蒽醌的检查：二羟基蒽醌为地蒽酚的制备原料及氧化分解产物，该杂质的三氯甲烷溶液在432nm的波长处有最大吸收，而地蒽酚在该波长处几乎无吸收。《中国药典》规定：地蒽酚加三氯甲烷制成每1ml中约含0.10mg的溶液，在432nm的波长处测定吸光度，要求不得超过0.12。即可控制杂质二羟基蒽醌的含量不大于2.0%。

硫酸阿托品中莨菪碱的检查：阿托品为外消旋体，无旋光性，莨菪碱为左旋体。检查方法：取本品，按干燥品计算，加水制成每1ml中含50mg的溶液，依法测定，旋光度不得超过-0.40^o。已知莨菪碱的比旋度为-32.5^o，控制游离莨菪碱的限量为24.6%。

3.色谱分析法

色谱分析法主要用于药物中特定杂质、有关物质与残留溶剂的检查，方法主要为薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法。

(1)薄层色谱法：常用方法有杂质对照法与自身稀释对照法，方法如下：

①杂质对照法：制备一定浓度的供试品溶液和相应的（浓度符合限度规定的）杂质对照品溶液，点样、展开、检测并比较。供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点（杂质斑点）与相应的杂质对照品溶液色谱图中的主斑点比较，颜色（或荧光）不得更深。

②自身稀释对照法：制备一定浓度的供试品溶液，取供试品溶液一定量，按照限度规定，稀释制成另一低浓度溶液作为对照溶液，点样、展开、检测并比较。供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点（杂质斑点）与相应的自身稀释对照溶液色谱图中的主斑点比较，颜色（或荧光）不得更深。

例如，布洛芬中“有关物质”检查：以自身稀释液(1%)为对照溶液，使用硅胶g薄层板，以正己烷-醋酸乙酯-冰醋酸(15：5：1)为展开剂，1%高锰酸钾的稀硫酸溶液为显色剂，于120℃加热20分钟后在紫外光(365nm)灯下检视，限度为1.0%。

(2)高效液相色谱法：常用方法有内标法、外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法和面积归一化法，方法如下：

①内标法：例如，《中国药典》检查丙酸倍氯米松粉雾剂的微细粒子剂量分布，以丙酸睾丸素为内标，按内标法以峰面积比值计算，微细粒子剂量药物量应不低于标示量的10%。

②外标法：例如，阿司匹林中“游离水杨酸”的检查，按外标法以峰面积计算，不得过0.1%。

③加校正因子的主成分自身对照法：例如，《中国药典》采用hplc法检查红霉素中有关物质，其中杂质d、杂质e和杂质f采用加校正因子的主成分自身对照法，即杂质e和杂质f按校正后的峰面积计算（乘以校正因子0.08）均不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%)，杂质d校正后的峰面积（乘以校正因子2）

不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%)，杂质a、杂质b及其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%)，各杂质校正后的峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的7倍(7.0%)，供试品溶液色谱图中小于灵敏度溶液主峰面积的峰可忽略不计。

④不加校正因子的主成分自身对照法：例如，阿司匹林中“有关物质”采用不加校正因子的主成分自身对照法，即供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除水杨酸峰外，其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(0.5%)。

⑤面积归一化法：例如，《中国药典》采用hplc法检查胰岛素中相关蛋白质，按面积归一化法计算，a₂₁脱氨胰岛素不得大于5.0%，其他相关蛋白质不得大于5.0%。

(3)气相色谱法：主要用于残留溶剂的检查，方法有：内标法、外标法和标准加入法。

①内标法：例如，《中国药典》采用gc检查头孢地嗪钠中的残留溶剂，按内标法以峰面积比值计算，含乙醇不得过2.0%，含乙腈、二氯甲烷的残留量均应符合规定。

②外标法：例如，《中国药典》采用gc检查氨苄西林钠中的残留溶剂，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷不得过0.2%，含丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、甲基异丁基酮、甲苯和正丁醇均应符合规定。

③标准加入法：例如，《中国药典》采用gc检查氨曲南中的残留溶剂，按标准加入法以峰面积计算，含乙醇不得过2.0%，甲醇与二氯甲烷均应符合规定。

（五）含量与效价测定

常用的含量测定方法有化学分析法与仪器分析法，其中化学分析法也称滴定分析法，仪器分析法主要有紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法；效价测定方法主要采用生物活性测定法，常用的方法有抗生素微生物检定法、升压素生物测定法等。

1．滴定分析法

滴定分析法是化学定量分析中的重要分析方法。该法是将一种已知准确浓度的标准溶液（滴定液）滴加到被测物质的溶液中，直到所加的标准溶液的量正好与被测物质按化学计量关系定量反应为止，然后根据所加标准溶液的浓度和体积，计算出被测物质的量。

滴定分析法的特点是操作简便、快速，测定结果准确可靠。因此，滴定分析法在药品检验中占有重要地位，并且是原料药含量测定的首选方法。

滴定分析法按滴定反应的类型，可分为酸碱滴定法、配位滴定法、氧化还原滴定法和沉淀滴定法。其中，酸碱滴定法根据滴定时所用介质的不同，又可以分为水溶液滴定法（一般称为“酸碱滴定法”）和非水溶液滴定法。

(1)酸碱滴定法：酸碱滴定法是以质子转移反应为基础的滴定分析方法。一般的酸、碱以及能与酸、碱直接或间接发生质子转移的物质，几乎都可以用酸碱滴定法测定。

酸碱滴定法中，通常采用酸碱指示剂来指示滴定终点的到达。常用的酸碱指示剂见表10-3。

(2)非水溶液滴定法：非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行的滴定分析方法。在非水溶剂中，药物的相对酸碱性得以提高，使在水中不能进行完全的滴定反应能够顺利进行。非水溶液滴定法包括非水碱量法和非水酸量法。

①非水碱量法：非水碱量法通常是以冰醋酸或冰醋酸-醋酐为溶剂，用高氯酸的冰醋酸溶液为滴定液（浓度为0.1mol/l）滴定，以结晶紫或电位法指示滴定终点的一类方法，在药品检验的含量测定中应用广泛。

非水碱量法主要用于测定有机弱碱及其氢卤酸盐、硫酸盐、磷酸盐、有机酸盐，以及有机酸的碱金属盐等药物。例如，地西泮、肾上腺素、盐酸麻黄碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品、硫酸奎宁、马来酸氯苯那敏、重酒石酸去甲肾上腺素、水杨酸钠、枸橼酸钾等药物的含量测定。

有机碱的氢卤酸盐由于氢卤酸的酸性较强，往往能够使滴定反应进行不完全。因此，在用高氯酸滴定液滴定之前，有时应先加入醋酸汞试液3~5ml，使形成难电离的卤化汞，以消除氢卤酸对滴定的干扰，然后再用高氯酸滴定液滴定。

②非水酸量法：非水酸量法通常是以乙二胺或二甲基甲酰胺为溶剂，用甲醇钠为滴定液，麝香草酚蓝作指示剂的非水溶液滴定法。非水酸量法主要用于测定有机弱酸或显酸性的酰亚胺类药物，例如《中国药典》采用非水酸量法测定乙琥胺的含量。

(3)氧化还原滴定法：氧化还原滴定法是以氧化还原反应为基础的一类滴定方法。氧化还原滴定法按滴定剂的不同可分为铈量法、碘量法、溴量法、溴酸钾法、重铬酸钾法、高锰酸钾法及亚硝酸钠法等。以下介绍在药品检验中应用较多的碘量法、铈量法及亚硝酸钠法。

①碘量法：碘量法是以碘作为氧化剂，或以碘化钾作为还原剂进行氧化还原滴定的方法。碘量法根据滴定的方式不同分为直接碘量法和间接碘量法，间接碘量法又分为置换碘量法和剩余碘量法两种。

直接碘量法（或称碘滴定法）是用碘滴定液直接滴定还原性药物的方法。直接碘量法在酸性或中性溶液中进行，用淀粉指示剂指示终点。

置换碘量法是先在供试品（氧化性药物）溶液中加入碘化钾，供试品将碘化钾氧化，置换出定量的碘，然后用硫代硫酸钠滴定液滴定置换出来的碘，用淀粉指示剂指示终点。

剩余碘量法是在供试品（还原性或生物碱类药物）溶液中先加入定量、过量的碘滴定液，待碘与被测组分反应完全后，再用硫代硫酸钠滴定液回滴定剩余的碘，淀粉作指示剂。淀粉指示剂应在近终点时加入。

维生素c、二巯丙醇等还原性强的药物的含量测定均可使用直接碘量法；复方对乙酰氨基酚片中咖啡因的含量可采用剩余碘量法测定。

②铈量法：铈量法也称硫酸铈滴定法，是以硫酸铈ce(so₄)₂为滴定剂，在酸性条件下测定还原性物质的滴定方法。铈量法通常采用邻二氮菲作指示剂。

铈量法可直接测定某些金属的低价化合物及有机还原性药物。同时铈量法还不易受制剂中淀粉、糖类的干扰，因此特别适合片剂，糖浆剂等制剂的测定。《中国药典》收载的硫酸亚铁片、葡萄糖酸亚铁及其制剂、富马酸亚铁及其制剂、硝苯地平等药物都是采用铈量法测定。

③亚硝酸钠滴定法：亚硝酸钠滴定法是用亚硝酸钠滴定液在盐酸溶液中与芳伯氨基定量发生重氮化反应，生成重氮盐以测定药物含量的方法。

由于重氮化反应为分子反应，速度较慢。若在滴定时向供试溶液中加入适量溴化钾(一般加入2g)，可使重氮化反应速度加快。

亚硝酸钠滴定法指示终点的方法《中国药典》采用永停滴定法指示终点。

亚硝酸钠滴定法在药物分析中应用较广，凡药物分子的结构中含有芳伯氨基或潜在的芳伯氨基，都可用该法进行滴定。如盐酸普鲁卡因的含量测定采用亚硝酸钠滴定法。

2.紫外-可见分光光度法

药物分子对特定波长的光的吸收程度除了与药物分子的结构有关外，还与药物溶液的浓度有关。单色光辐射穿过对光有吸收的药物溶液时，在一定的浓度范围内被药物分子吸收的量与药物分子的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比。其关系式如下：

式中，a为吸光度，i₀为入射光强度，i为透射光强度，t为透光率，e为吸收系数，c为被测药物溶液的浓度，i为液层厚度。

药物分子对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数e是该药物的物理常数。随浓度c单位的不同，吸收系数e有不同的意义和表示方法。

当c以“mol/l”为单位时，e称为摩尔吸收系数，用ε表示。

当c用“g/100ml”为单位时，e称为比吸收系数，用表示。

在药品检验中常采用，简称吸收系数，其物理意义为当溶液浓度为1%(1g/100ml)、液层厚度为1cm时，在一定条件（波长、溶剂、温度）下的吸光度。

根据上式，在一定条件下，吸光度(a)与溶液浓度(c)和光路长度(l)成正比，这是紫外-可见分光光度法用于药物定量测定的依据。当已知某药物纯品在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将药物供试品制成溶液，测定其吸光度，即可根据上式计算出供试品中该药物的含量。

紫外-可见分光光度法用于药物含量测定的方法主要有对照品比较法和吸收系数法，目前各国药典主要采用对照品比较法。

3.高效液相色谱法

(1)内标法：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别制成溶液，精密量取各溶液，混合配成校正因子测定用的对照溶液。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，计算校正因子(f)，再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品溶液中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

式中，a_x、a_s分别为待测组分与内标物质的峰面积或峰高；c_s为内标物质的浓度。

采用内标法，可避免样品前处理及进样体积误差对结果的影响。当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，则制备内标物质溶液时不必精密称（量）取。

(2)外标法：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，分别制成溶液，各精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：

式中，a_x为供试品溶液色谱中待测组分的峰面积或峰高；a_r为对照品溶液色谱中对照品的峰面积或峰高，c_r为对照品溶液的浓度。

例如，《中国药典》采用外标法测定炔诺酮含量。

4.抗生素微生物检定法

本法系在适宜的条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。本法包括两种方法：管碟法和浊度法。

(1)管碟法：系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，以测定供试品效价。

(2)浊度法：系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价。常用的检定法是标准曲线法。

例如，《中国药典》采用本法测定硫酸庆大霉素的含量：精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1ml中含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法的管碟法或浊度法测定。可信限率不大于7%。1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素。

（六）微生物限度检查法

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

1.计数法与方法验证

本法的计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。本法在供试品检查之前须进行计数培养基的适用性检查和计数方法验证。

2.供试品检查

检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌、酵母菌菌数测定。按计数方法的验证试验确认的程序进行供试品溶液的制备与培养。

3.试验条件与结果报告

除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃~35℃，时间为3天；霉菌、酵母菌培养温度为23℃~28℃，时间为5～7天。

4.应用

本项检查主要适用于局部用制剂（如口腔贴片、阴道片、阴道泡腾片、外用可溶片、栓剂、软膏剂、凝胶剂等）和口服液体制剂（如酊剂、糖浆剂、口服溶液等）的限度检查。

知识点二、药品质量检验

大纲要求：

1.药品监督机构

2.药品检验类别

3.药品检验报告

（一）药品监督检验机构

国家食品药品监督管理总局(cfda)下设的中国食品药品检定研究院，承担各省级（省、自治区、直辖市）药品检验所（或称：食品药品检验所，药品检验检测院等）的技术考核与业务指导，国家药品标准物质的标定，药品注册检验（包括样品检验和药品标准复核）及进口药品的注册检验与药品监督（评价性）检验和复验（仲裁检验）等工作；

各省级（食品）药品检验所承担辖区内药品的抽验与委托检验（口岸药检所承担药品进出口检验）以及药品的注册检验；各市（县）级药品检验所，承担辖区内的药品监督检查与管理工作。药品生产企业的质量保证(qa)与质量管理(qc)部门依据药品质量标准的规定和药品检验实验室的具体条件制定相应的标准操作规范(sops)．并实施企业内药品的生产过程监控与出厂检验。

（二）药品检验的类别

依据检验的目的，药品检验可分为：出厂检验、委托检验、抽查检验、复核检验、审核检验、仲裁检验或进出口检验等。

1.出厂检验

药品出厂检验系药品生产企业对放行出厂的产品按企业药品标准进行的质量检验过程。

2.委托检验

药品生产企业由于缺少使用频次较少的检验仪器设备而无法完成的检验项目，可以实行委托检验，但要求受托检验方为具有相应检测能力并通过实验室资质认定或实验室认可的检验机构，或具有相应检测能力并通过gmp认证的药品生产企业。

3.抽查检验

国家依法对生产、经营和使用的药品按照国家药品标准进行抽查检验，抽查检验分为评价抽验和监督抽验。国家药品抽验以评价抽验为主，省级药品抽验以监督抽验为主。

(1)评价抽验：是药品监督管理部门为掌握、了解辖区内药品质量总体水平与状态而进行的抽查检验工作。

(2)监督抽验：是药品监督管理部门在药品监督管理工作中，为保证用药安全而对监督检查中发现的质量可疑药品所进行的有针对性的抽验。

4.复核检验

复核检验（简称复验）系对抽验结果有异议时，由药品检验仲裁机构，如中国食品药品检定研究院对有异议的药品进行的再次抽验（仲裁检验）。复核检验亦包括对药品注册标准的审核检验。

5.进口药品检验

对于已经获得《进口药品注册证》或批件的进口药品，进行的检验为“进口检验”，并核发“进口药品检验报告书”；对进口小样的检验系“（进口）委托检验”。为申请《进口药品注册证》对质量标准进行的复核检验为“（进口药品质量标准）复核检验”，并核发“进口药品检验报告书”。

（三）药品检验报告书

1.检验记录与检验卡

检验记录与检验卡是出具检验报告的依据，为保证药品检验工作的科学性和规范化，检验记录应原始、真实，记录完整、简明、具体，书写字迹应清晰，色调一致，不得任意涂改。若发现记录有误，可用单线或双线划去（删除），但应保持原有字迹可辨，并在修改处签名或盖章，以示负责。

检验前，应注意检品标签与所填检验卡的内容是否相符，核查检品编号、品名、规格、批号和有效期，生产单位、检验目的和收样日期，以及样品数量和封装情况。

检验过程中，按检验顺序依次记录检验项目名称、检验日期、操作方法、实验条件、观察到的现象或检测数据、数据处理（结果计算）以及结果判定。检验结果无论成败（包括复试）均应详细记录；对废弃的数据或失败的检验，应及时分析其可能的原因，并在原始记录中注明。

检验工作完成后，应将检验记录逐页顺序编码，根据各项检验记录填写检验卡，并对检验作出明确结论。

2.检验报告书

药品检验报告书记载了药品检验机构依据公正数据对药品质量作出的技术检定结论，是向社会出具的具有法律效力的技术文件，对药品检验结果的判定必须明确、有依据。药品质量标准中的检验项目是相互联系的，判断药品是否符合要求，应根据检品的性状、鉴别、检查和含量或效价测定的检验结果综合评价。

药品检验报告书应记载的内容有：品名、规格、批号、数量、包装、有效期、生产单位、检验依据：取样日期、报告日期；检验项目、标准规定、检验结果；检验结论。药品检验报告书上须有检验者、复核者（或技术部门审核）和部门负责人（或管理部门批准）的签章及检验机构公章，签章应写全名，否则该检验报告无效。

以某企业左氧氟沙星片的出厂检验报告为例，如下：

 

①药品监督检验机构，如药品检验所出具的药品检验报告书的抬头为“xx省（市、自治区）食品药品检验所药品检验报告书”，例如：云南省食品药品检验所药品检验报告书、上海市食品药品检验所药品检验报告书。

②检验报告书编号通常为8位数，前4位数为年份，后4位数为顺序编号，也可添加检验类别代码。

③药品监督检验机构检验签发的药品检验报告书，通常在[检验项目]栏的最后空白处打印或加盖“以下空白”字样或印章，以示报告内容的完结。

④药品监督检验机构检验签发的药品检验报告书，签名为：授权签字人及签发日期。

知识点三、体内药物检测

大纲要求：

1.体内样品的种类

2.体内样品的测定

3.药动学参数的测定

为确保临床治疗的安全有效，应根据患者的具体情况和药物的药效学特性拟定个性化的给药方案，而给药方案的设计与调整基于药物在患者体内的动力学行为特征；药品注册申请需提供药物在动物体内或健康志愿者体内的动力学行为特性或生物利用度与生物等效性数据。上述临床治疗药物监测与药物动力学研究均离不开体内药物浓度的检测。

（一）体内样品的种类

在体内药物检测中最为常用的样本是血液，因为它能够较为准确地反映药物在体内的状况。尿液中常因为含有丰富的代谢物，也被较多地使用。唾液因其采集便利，且有时与血浆游离药物浓度具有相关性而时有使用。而活体组织，除非特别需要，在临床治疗药物监测中很少使用，更多地用于药物临床前动物体内组织分布研究。

体内样品的采集时间对测定结果的临床意义影响很大，是开展临床治疗药物监测必须考虑的基本问题。采集时间应在药物动力学理论的指导下，根据临床治疗药物监测的不同目的确定。

1.血样

血样包括全血、血浆和血清，它们是最为常用的体内样品。血药浓度监测，除特别说明是全血外，通常都是指血浆或血清中药物浓度的测定。当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物的浓度能够反映药物在靶器官的状况。因而，血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。

(1)血样（全血）的采集

动物实验时，可直接从静脉、动脉或心脏取血。对于患者或健康志愿者，通常采集静脉血，有时根据血药浓度和检测方法的灵敏度，也可于耳垂或指尖用毛细管采血。血样的采集时间由测定目的和药物动力学参数决定。全血采集后置含有抗凝剂（例如：肝素、edta、草酸盐、枸橼酸盐等）的试管中，混合均匀，即得。血浆或血清由采集的全血制备。

(2)血浆的制备

将采集的全血置含有抗凝剂的离心管中，混匀后，以约1000xg离心力离心5~10分钟，分取上清液即为血浆，血浆量约占全血量的50%～60%。

(3)血清的制备

将采集的全血置不含抗凝剂的试管中，在室温或37℃下放置0.5~1小时，待血液凝固后，再以约1000xg离心力离心5~10分钟，分取上清液即为血清，血清量约占全血量的20%~40%。

因为药物与血浆纤维蛋白几乎不结合，所以，血浆与血清中药物的浓度通常相近。血浆比血清分离快、制取量多，因而较血清更为常用。如果抗凝剂与药物可能发生作用，并对药物浓度测定产生干扰，则以血清为检测样本。

血样采集后应及时分离血浆或血清，并最好立即进行检测。如不能立即进行测定，应根据药物在血样中的稳定性及时处置，置于具塞硬质玻璃试管或ep管中密塞保存。

2.尿液

尿液中药物浓度大都较高，采集方便且采集量大，但尿液浓度通常变化较大。所以，尿液药物浓度测定的目的通常与血液或唾液样品的测定目的不同，主要用于药物尿液累积排泄量、尿清除率或生物利用度的研究，以及药物代谢物及其代谢途径、类型和速率等的研究。在临床上，亦可推断患者是否违反医嘱用药。

测定尿液中药物浓度时应采集特定时间间隔内的尿液。测定尿液中药物的排泄量时，应收集用药后一定时间内（如24小时，或至基本完全排泄的其他时间），不同时间区段排泄的全部尿液，记录体积后，量取一部分用于药物浓度的测定，再乘以尿液量，计算即可求得尿药排泄量。

尿液在放置时可因细菌繁殖而变混浊，因此，尿液采集后应立即测定。若不能立即测定（如需收集24小时的尿液），必须采集后立即处置，低温保存或加入防腐剂后冷藏保存。常用的防腐剂有二甲苯、氯仿、醋酸或盐酸等。保存时间在36小时以内，可置冰箱冷藏；若需长时间保存，则应冰冻贮藏。

（二）体内样品的测定法

体内样品测定常用的方法有免疫分析法和色谱分析法。

1.免疫分析法

免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性竞争反应而建立的一种生物化学分析法。具有很高的选择性和很低的检出限，可以应用于测定各种抗原、半抗原或抗体。

免疫分析法分为放射免疫法和荧光免疫法、发光免疫法、酶免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法，测定的量可以达到μg甚至ng的水平。

2.色谱分析法

色谱分析法包括：气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)和色谱-质谱联用法(gc-ms、lc-ms)等，这些方法适用于体内复杂样品中微量药物的专属准确定量。

（三）药物动力学参数的测定

1．体内样品的采集

在急性药物中毒诊断时，应立即取样测定；当治疗药物监测时则可根据临床需要确定取样时间；当测定药物动力学参数时，大多采集给药前与给药后，药物及其代谢产物在体内的吸收、分布、代谢和排泄各阶段多个时间点的样本。

2.药物动力学参数测定示例

目前临床上用于心衰治疗的强心苷类药物有毒毛花苷k、去乙酰毛花苷、地高辛、洋地黄毒苷等。其中，前两者因起效快、消除快、作用维持时间短，仅有注射剂供急症短期使用，一般无需进行治疗药物监测。洋地黄毒苷则因起效慢、消除慢、一旦中毒很难解救，临床偶尔使用，在需长期使用强心苷时，一般均选用地高辛。

在肾功能减退时，地高辛的代谢与肠肝循环比率可明显升高，并可使消除半衰期延长，血药浓度显著升高，从而有可能引起毒性。同时使用奎尼丁、钙拮抗剂、胺碘酮、普罗帕酮等心血管系统药，药物相互作用也可导致地高辛血药浓度升高。使用地高辛中毒仍是临床常见的急诊病例，尤其是老年患者。

地高辛的治疗药物监测十分重要。血清免疫法常用于临床快速监测，更专属灵敏的液一质联用法则常用于临床药物动力学及经时过程的研究。例如，以洋地黄毒苷为内标，对人血浆和尿中地高辛浓度进行lc-ms测定：

(1)样品处理方法：精密吸取血浆样品1.0ml，置具塞离心管中，精密加入内标溶液(20ng/ml)50μl,加浓氨水100μl和甲基叔丁基醚5ml，振荡混匀30分钟后，3000xg离心10分钟，分取有机层，置另一离心管中，减压离心挥干，残留物用100μl含0.25mmol/l醋酸钠的甲醇-水(40：60)流动相溶解，14000xg离心2分钟，取上清液15μl进行lc-ms分析。尿样用空白尿按1：10或1:50稀释后照血浆样品同法处理和测定。

(2)色谱和质谱条件：色谱柱c₈(2.1mmx50mm，5μm)柱，流动相含0.25mmol/l醋酸钠的甲醇(a)-水(b)梯度洗脱，流速0.25ml/min。电喷雾正离子化，喷雾电压5000v，传输裂解电压250v，干燥氮气温度350℃，流速10.0l/min，喷雾口气压25psi。选择性离子[m+na]+监测(sim)，m/z分别为803.4（地高辛）和787.4（洋地黄毒苷）。

(3)测定结果：血浆浓度线性范围0.05~1.5ng/ml，应用于人体药物动力学研究，测得女性受试者口服0.25mg地高辛后的平均血浆浓度一时间曲线如图10-4，主要药物动力学参数如下：血浆浓度达峰时间t_max=1.5h，峰浓度c_max=0.93ng／ml，消除半衰期t_1/2=40.8h。尿液48小时累积排泄量为30.2%。