公卫执业医师

血清学诊断(补充件)

B1 检测抗体

B1.1 间接荧光抗体试验(IFA)

一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血滴法。

B1.1.1 抗原片：收集经三恩氏(NNN)基培养10天左右的利什曼原虫前鞭毛体，离心沉淀(3000r/min)15min，弃上清液，加生理盐水冲匀，再经离心洗涤3次后，用含0.2%福尔马林0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定，置冰箱内1h取出，离心沉淀，弃上清，再用PBS洗涤一次，稀释至每个视野50～100个鞭毛体，滴于玻片上，电扇吹干。此抗原片，可置-20℃冰箱中备用。

B1.1.2 干血滴的制备：在滤纸上圈画1.2cm直径的圆圈，在圈内滴入2滴(相当于20mm3)病人耳垂血，晾干后放入装有干燥剂的塑料袋内，置冰箱保存待查。

B1.1.3 从滤纸上剪下干血滴，以0.2mL0.01mol/L pH7.2的PBS浸泡，相当于1∶20血清的稀释度(如被检样本为血清，则作1∶20稀释)，置冰箱内过夜。试验时继续作倍比稀释至1∶320或1∶640，把不同稀释度的血清或干血滴浸泡液分别滴在抗原片上，置湿盒内于37℃温育30min后，用pH7.2～8.0的PBS缓慢洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS浸泡10min，继续用蒸馏水洗一次，电扇吹干。

B1.1.4 分别滴加1∶10稀释的荧光标记的羊抗人IgG，置湿盒内于37℃温育30min，如前清洗，电扇吹干待检。

B1.1.5 检查时在玻片上加蒸馏水一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜或用6×40倍的光学显微镜在高压汞灯荧光光源的配合下进行观察。阳性者虫体的胞浆及鞭毛呈黄绿色荧光，轮廓清楚，而核及动基体一般不显荧光。

B1.1.6 每次试验均以病人干血滴(或血清)和正常人干血滴(或血清)浸泡液及PBS作对照，由于正常人血样在1∶20稀释时亦偶可出现“+”，故以“+”为阳性标准，并以1∶20(即1∶20++)为最低阳性稀释度。

B1.2 PVC薄膜快速ELISA

B1.2.1 抗原(前鞭毛体可溶性抗原)：收集利什曼原虫前鞭毛体，以生理盐水离心洗涤3次，按压积体积加10倍量的0.01%硫柳汞生理盐水，在冰浴中超声处理2次，每次10min，反复冻融5次，经4000r/min离心3min，上清液存-20℃贮存备用。

B1.2.2 操作方法：

B1.2.2.1 实验前先在PVC致敏膜背面上编号，然后每孔加血清稀释液(PBS/T)0.2mL。

B1.2.2.2 按编号加入待测血清及参考血清(每批设一个阴性对照，一个阳性对照)，每孔10μL，混匀置37℃ 5min(如放25℃室温，则需10min)。

B1.2.2.3 温育后，倾去稀释血清，用洗涤液(NaCl/T)连续洗8次，空干。

B1.2.2.4 加入按工作浓度稀释的酶结合物，每孔0.2mL，放37℃内5min。

B1.2.2.5 倾去酶结合物，先用洗涤液洗8次，再用蒸馏水洗一次，空干。

B1.2.2.6 加入已加3%过氧化氢(H2O2)的四甲基联苯胺(TMBs)底物液，每孔0.2mL，反应5～10min，即可观察结果。

B1.2.3 反应标准：

目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性为鲜蓝色，阴性基本无色。

分光光度计比色判断：不用过氧化氢(H2O2)终止，选用595nm波长比色，以P/N≥ 2.1判为阳性(P-患者的光密度值;N-正常人的光密度值)。

B1.3 间接血凝法(IHA)

B1.3.1 取培养10～12天的利什曼原虫前鞭毛体，用生理盐水洗涤，按压积量加4倍生理盐水，于冰浴中用150W，18kc，300mA功率超声处理10s，以pH6.4，0.075mol/L的PBS稀释20倍。Folin酚试法测蛋白量为200μg/mL。

B1.3.2 醛化：用健康人“O”型红细胞加10倍生理盐水离心4～5次。每8mL压积红细胞加1%戊二醛100mL，在4℃水浴中摇动30min，醛化红细胞再用生理盐水和蒸馏水或去离子水各洗5次，最后稀释成15%，另加万分之一硫柳汞防腐，置冰箱内保存。

B1.3.3 致敏：用pH7.2，0.75mol/L的PBS将醛化红细胞稀释为1.5%，离心洗3次，配成5%的细胞悬液加等量万分之一的鞣酸溶液，置37℃水浴中30min，每3～5min摇一次，用5倍量上述的PBS洗3次，再用pH6.4，0.075mol/L的PBS配成2.5%的红细胞悬液，然后以此红细胞悬液加等量pH6.4的PBS稀释20倍的抗原，在37℃水浴中致敏45min，并加摇动，2000r/min离心3min后弃上清，加pH7.2的PBS重复离心一次，最后以含有1%正常兔血清的pH7.2的PBS配成1%备用。

B1.3.4 将定量生理盐水滴加于稀释板上，于第一孔内加等量待检血清，混匀并倍比稀释成2-1，2-2…2-12等浓度。取每一浓度血清0.025mL分别加入微量血凝板的12个6mm×7mm的"V"井内，再加等量致敏红细胞摇匀，置于湿纱布盒内，经室温1h后判定结果，同时用参考阳性和阴性血清作对照。凡患者血清稀释度达2-7凝集者作阳性阈值，无凝集者为阴性反应。

B2 检测循环抗原

B2.1 单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST)

B2.1.1 待检血清递次作倍比稀释，分别取2μL滴于硝化纤维滤膜(0.45μm)上，室温放置30min。

B2.1.2 将滤膜浸入标准缓冲液(0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷)(Tris)-HCl pH7.4. 0.25%明胶，0.5%NP-40)内，室温2h。

B2.1.3 取出滤膜浸入McAb-C-2(1∶100稀释)内，4℃过夜。

B2.1.4 以缓冲液洗涤后与辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠IgG(1∶1000)，于室温中孵育2h。

B2.1.5 洗涤后将滤膜置二氨基联苯胺底物液中，室温内反应30min，蒸馏水洗涤终止反应。

B2.1.6 滤膜干燥后目测以出现深棕色或棕色斑点，边缘清晰，直径较正常人血清反应为大者则判为阳性反应。未出现棕色斑点，与正常对照血清反应相近者为阴性反应。为更精确阅读结果，可待滤膜干燥后用岛津双波长TLC扫描仪(CS-910，S 460nm)测读光密度面积积分(Integral of surface area.ISA)，阈值>1.0以上者为阳性反应;阈值<1.0为阴性反应。

B2.2 酶标记单克隆抗体斑点-ELISA直接法(McAb dot-ELISA)

B2.2.1 以戊二醛二步法标记提纯的单克隆抗体制备成HRP-McAb L12F7，-30℃保存备用。

B2.2.2 将待测血清依次作倍比稀释至1∶8.吸取2μL样本滴于硝酸纤维膜上，4℃阴干。

B2.2.3 滴有血清的硝酸纤维(NC)膜置于标准缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl pH7.4 0.25%明胶，0.5%NP-40)内，室温摇床洗涤4次，每次10min。

B2.2.4 洗涤后加1∶100稀释的HRP-McAb，室温摇床2h，标准缓冲液洗涤6次，每次10min。

B2.2.5 加底物4-氯乙萘酚摇床10min，水洗中止反应。

B2.2.6 目测以出现蓝灰色斑点者为阳性反应。阴性则无蓝灰色斑点或仅有血清痕迹。

B2.2.7 每次试验均需设有阳性及阴性对照。

B2.3 单克隆抗体酶联免疫电转移印斑技术(McAb-EITB)

B2.3.1 血清样品处理：每份待检血清各取50μL，加pH7.4的PBS至1mL，3000r/min30min，取上清加0.2mL30%聚乙二醇(PEG分子量6000)，4℃过夜，3000r/min30min，再以50%PEG洗涤，3000r/min30min，最后沉淀物加50μLPBs溶解备用。

B2.3.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术：实验使用10%分离胶(浓缩液3.3μL，3mol/L Tris-HCl 1.25mL，10%十二烷基硫酸钠(SDS)100μL，四甲基乙二胺(TEMED)5μL，10%过硫酸胺Ap50μL)。3%浓缩胶(浓缩液0.5mL，1mol/LTris-HCl 0.625mL，H2O23.8mL，10%SDS50μL，TEMED5μL，10%Ap25μL)。待胶板聚合完成后，每槽上样处理血清2μL.将制板插入电泳槽中，200V电泳50min。

B2.3.3 电泳转移：将胶膜覆盖在硝酸纤维膜上对正，排除气泡。开动电源，电流为200mA，电压为15V，电泳30min即可。

B2.3.4 转移后硝酸纤维膜用标准缓冲液(Tris-HCl pH7.4，明胶0.25%，0.5NP-40)洗三次，每次10min。

B2.3.5 加1∶500稀释的HRP-McAb L12H4，37℃1h后4℃过夜，标准缓冲液洗三次，DAB-H2O2系统显色10min，水洗中止反应。

B2.3.6 目测特异性条带，以130kD、100kD和25kD为阳性条带。

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（责任编辑：xy）

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