公卫助理医师

血清免疫学检查(补充件)

B1 环卵沉淀试验(COPT)

B1.1 常用方法

B1.1.1 虫卵：热处理超声干燥虫卵粉。以重感染兔血清(接种尾蚴1500～2000条，42天的兔血清)测试环沉率>30%为合格。

B1.1.2 操作方法：先用熔化的石蜡在洁净的载玻片两端分别划两条相距20mm的蜡线，在蜡线之间加受检者血清2滴(0.05～0.10mL)，然后用针头挑取干卵约100～150个，加入血清中，混匀，覆以24mm×24mm盖玻片，四周用石蜡密封后，置于37℃温箱中，经48～72h后用低倍(80～100×)显微镜观察反应结果，疑似者应在高倍(400×)显微镜下加以识别。

为简化操作亦可选用预制干卵PVC膜片，只需加入血清，置湿盒中37℃保温经24h取出，倾去血清，加少量盐水显微镜下观察反应。

B1.1.3 反应标准：典型的阳性反应为泡状、指状或细长卷曲的带状沉淀物，边缘较整齐，有明显的折光。其中泡状沉淀物须大于10μm(约相当于两个红细胞大小)，才能定为阳性。阳性反应的标本片，应观察100个成熟虫卵，计算其沉淀率;阴性者必须看完全片。

阴性反应：虫卵周围光滑，无沉淀物;或有小于10μm的泡状沉淀物。

阳性反应的强度和环沉率：

a. “+”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积小于虫卵面积的1/4;细长卷曲的带状沉淀物小于虫卵的长径。

b.“++”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/4;细长卷曲的带状沉淀物相当于或超过虫卵的长径。

c. “+++”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/2;细长卷曲的带状沉淀物相当于或超过虫卵长径的2倍。

B1.2 双面胶纸条法

B1.2.1 虫卵：热处理超声干燥虫卵粉。以25mg/mL的重感染兔血清y-球蛋白为标准血清，测试环沉率>30%为合格。

B1.2.2 操作方法：取国产打有双圆孔的双面胶纸(厚度约150μm，圆孔直径16mm孔，间距8mm)，先将其一面的覆盖纸揭去，然后粘贴于载玻片上，胶纸条须与玻片紧密粘牢，不能留有空隙。然后再揭去胶纸条上面的覆盖纸，用适宜的滴管滴加2滴约50μL血清于圆孔中，覆以盖玻片(22mm×22mm)后，置37℃孵箱中，观察48～72h结果。

B1.2.3 反应标准：同B1.1.3。

B2 间接血球凝集试验(IHA)

B2.1 常用方法

B2.1.1 抗原：为用葡聚糖凝胶G100初步纯化的可溶性血吸虫卵抗原致敏的绵羊红细胞。所用绵羊红细胞先经2.5%戊二醛醛化及1∶5000鞣酸溶液鞣化后再行致敏。致敏后的红细胞以含10%蔗糖及1%正常兔血清的pH7.2PBS配5%悬液，分装安瓿低压冻干封存。每批致敏红细胞作效价测定，滴度达1∶1280～2560为合格。

B2.1.2 操作方法：

B2.1.2.1 启开安瓿，每支以1mL蒸馏水稀释混匀备用。

B2.1.2.2 用微量滴管加4滴(0.025mL/滴)生理盐水于U型微量血凝反应板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。

B2.1.2.3 第一孔内储存待检血清，并从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后，吸出两滴于第三孔和第四孔各加1滴。在第四孔混匀后弃去1滴使第三孔、第四孔血清稀释度分别为1∶5，1∶10。

B2.1.2.4 用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔内各加1滴，立即旋转震摇2min，室温下静置1h左右，观察结果。

B2.1.2.5 每次试验均应有阳性血清及生理盐水作阳性和阴性对照。

B2.1.3 结果判断：

B2.1.3.1 阴性反应为红细胞全部沉入孔底，肉眼见一边缘光滑，致密的小圆点。

B2.1.3.2 阳性反应。

++++红细胞形成薄层凝集，边缘呈现不规则的皱褶。

+++ 红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底。

++ 红细胞形成薄层凝集，面积较+++者小。

+ 红细胞大部分沉集于孔底，形成一圆点，周围有少量凝集的红细胞，肉眼见周边模糊(或中间出现较为明显的空白点)。

B2.1.4 反应标准：以血清1∶10稀释出现阳性反应可判为血吸虫病患者。

B2.2 二氨酚致敏法

B2.2.1 抗原：为日本血吸虫虫卵可溶性抗原(SEA)及成虫尿素溶解性抗原(AUA)混合而成，其比例为SEA10mg/L十AUA20mg/L.所用绵羊或人"O"型红细胞经5%戊二醛醛化后，用二氨酚法致敏。致敏后的红细胞中加入含10%蔗糖及1%正常兔血清的pH7.2PBS，分装后冻干保存。每批致敏红细胞以阳性参考血清作效价测定滴度达1：640～1280，阴性血清及盐水对照不出现凝集者为合格。

B2.2.2 操作方法

B2.2.2.1 冻干致敏红细胞为每支0.5mL，使用前用1mL生理盐水稀释摇匀。

B2.2.2.2 在“V”型(90°)血凝板中，将受检血清用生理盐水做1：5～1：640倍比稀释。

B2.2.2.3 除1∶5稀释孔外，其余每孔加滴(0.03mL)致敏红细胞，振荡30s，静置60～90min观察反应结果。

B2.2.3 反应标准：以110稀释孔呈强凝集(+++)为阳性反应。

B3 酶联免疫吸附试验(ELISA)

B3.1 常用方法

B3.1.1 抗原：虫卵可溶性抗原。

B3.1.2 操作方法

B3.1.2.1 于微量聚苯乙烯塑料板的凹孔中加入0.2mL以pH9.6碳酸盐缓冲液作1∶3000(或1∶1000，随抗原效价而定)稀释的虫卵抗原，置4℃过夜。

B3.1.2.2 次日倾去抗原，用含有0.05%吐温-20的磷酸缓冲盐水(PBS/TpH7.4，0.01mol/L)洗涤3次，每次5min。

B3.1.2.3 于凹孔中加入以PBS/T作1∶200稀释的受检者血清0.2mL，37℃ 2h。

B3.1.2.4 倾去血清，以PBS/T洗涤3次，每次5min。

B3.1.2.5 加入以PBS/T作1∶1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-标记结合物0.2mL，37℃ 2h。

B3.1.2.6 倾去酶标记结合物，以PBS/T洗涤3次，每次5min。

B3.1.2.7 加入0.2mL邻苯二胺(OPD)底物溶液〔10mg OPD+pH5.0柠檬酸缓冲液25mL+30%过氧化氢(H2O2)10μL 0.2mL，37℃，30min。

B3.1.2.8 在各凹孔中加入2mol/L硫酸(H2SO4)0.05mL以中止反应。

B3.1.2.9 在酶标专用比色计上读取492nm光密度(OD)值。

B3.1.2.10 每次实验均设阳性参考血清对照，同法求出其OD值。以此对样本血清OD值进行校正。

B3.1.3 反应标准：据Dynatech酶标专用比色计测定结果OD值≥0.5为血吸虫阳性。

B3.2 使用纯化抗原的ELISA法

B3.2.1 抗原：经50%～75%饱和硫酸铵纯化的日本血吸虫虫卵可溶性抗原(AEA)。

B3.2.2 操作方法：

B3.2.2.1 已包被AEA抗原的40孔聚苯乙烯塑料板用前以PBS/T(pH7.4)洗涤1次。

B3.2.2.2 血清用PBS/T稀释成1∶200，每孔加0.1mL，每份血清加2个孔，置有盖湿盒内，20-37℃温育30min。

B3.2.2.3 去尽反应板孔内的液体，用PBS/T灌满各孔，3～5min后去尽孔内液体，如此反复洗涤3次。

B3.2.2.4 每孔加1∶1000稀释辣根过氧化物(HRP)酶结合物0.1mL，同B3.2.2.2～B3.2.2.3温育和洗涤。

B3.2.2.5 加OPD底物溶液(OPD20mg+pH5.0柠檬酸磷酸盐缓冲液50mL，用前加30%H2O220μL)0.1mL，同B3.2.2.2温育。

B3.2.2.6 每孔加2mol/LH2SO425μL，终止反应。

B3.2.2.7 用酶标检测仪读取492nm的消光值。每份标本求出2孔实测的OD平均值，再用标准血清予以校正。

B3.2.3 反应标准：每次每板标准血清的OD值应控制在0.79～1.15范围，若达不到此质控范围，应重测试。

标本OD值≥0.5判为阳性。

B3.3 PVC薄膜快速酶联免疫吸附法(ELISA)

B3.3.1 抗原：日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)与8mol/L尿素溶解性虫卵抗原(JEU)等量混合。

B3.3.2 操作方法：

B3.3.2.1 实验前先在已包被抗原的PVC薄膜背面编号，洗涤液(0.05%吐温盐水)洗一次，然后每孔加PBS/T0.2mL.

B3.3.2.2 按编号加入待测血清及参考血清(每批作一个阴性对照，一个阳性对照)，每孔10μL，混匀，置37℃ 5min(如放25℃室温，则10min)。

B3.3.2.3 孵育后，倾去稀释血清，用洗涤液连续洗8次，控干。

B3.3.2.4 加入按工作浓度稀释的酶结合物，每孔0.2mL放37℃ 5min。

B3.3.2.5 倾去酶结合物，先用洗涤液洗8次，再用蒸馏水洗一次，控干。

B3.3.2.6 加入已加3%H2O2的四甲基联苯胺(TMBS)底物液，每孔0.2mL，反应5～10min即可观察结果。

B3.3.3 反应标准：

B3.3.3.1 目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性为鲜蓝色，阴性基本无色。

B3.3.3.2 分光光度计比色判断：不用H2SO4终止，则选用590nm波长比色，以P/N≥2.1判为阳性(P——病人OD值;N——正常人OD值)。

B4 胶乳凝集试验(LA)

B4.1 血清标本用生理盐水1：10稀释。

B4.2 在反应板(黑色，与妊娠诊断胶乳试验使用的相同)各格子上分别滴加稀释血清以及阳性和阴性控制血清各1滴(50μL)。

B4.3 滴加血吸虫胶乳试剂1滴(50μL)，轻轻摇动10min，有清晰凝集者为阳性，不出现凝集者为阴性。

B4.4 1∶10稀释血清阳性者可进一步倍比稀释，重复上述测定，呈现凝集的血清最高稀释度即为抗体滴度。

B5 单克隆抗体斑点酶联试验(Dot-ELISA)

B5.1 用取样环将待测血清点滴至NC纤维膜(以毛面为正面)上，置70℃ 30min或37℃ 2h。将点好的纤维膜连同参考阳性和参考阴性血清的纤维膜一并置染色盘内。

B5.2 将1号试剂(PBS)加200mL蒸馏水，充分溶解后即为PBS溶液。

B5.3 取上述PBS溶液150mL，加2号试剂(吐温)，充分混匀后即为PBS-吐温溶液。

用此溶液20mL封闭洗涤纤维膜30min，倾去溶液。

B5.4 取3号试剂(单抗酶结合物)加PBS-吐温溶液10mL，充分混匀后加至含纤维膜的染色盘内。置室温0.5～1h，中间轻摇数次，倾去溶液。

B5.5 用PBS-吐温溶液洗涤纤维膜3次，每次5min，倾去溶液。

B5.6 将4号试剂(底物)加PBS溶液(无吐温)20mL，混匀后再加5号试剂(H2O2)然后加至染色盘中，轻摇数次，15min后倾去底物溶液。用蒸馏水洗涤2次以终止反应。染色后的纤维膜置暗处晾干保存。

B5.7 仔细观察纤维膜上所呈的颜色反应，并与参考血清所呈现的斑点显色反应相比较。以斑点色泽超过参考阴性血清者为阳性反应。根据阳性反应强度可判以+～+++反应。

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（责任编辑：xy）

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