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临床执业医师考试病理学知识点精讲

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第十九节 免疫性检测技术

大纲要求：

1.抗体的检测及应用(1)概念(2)沉淀反应(3)凝集反应和血型的鉴定(4)免疫荧光(5)放射免疫(6)酶免疫(elisa和免疫组化)(7)化学发光(8)免疫电镜(9)免疫沉淀(10)免疫印迹(11)亲和层析

2.免疫细胞的分离(1)ficoll-hypaque离心法(2)磁珠分离法(3)流式细胞术

3.免疫细胞的特异性、数量和功能检测(1)流式细胞术(2)酶免疫斑点试验(3)细胞因子的细胞内染色(4)四聚体法(5)增殖试验(6)细胞毒试验(7)细胞凋亡检测(8)芯片技术(9)细胞因子的生物活性检测

讲义内容：

一 抗体的检测及应用抗体进行的检测

1. 概念：免疫学检测的基本原理是抗原-抗体的特异性结合，其特点为：高特异性、可逆性、抗原抗体浓度和比例决定出现免疫复合物的性状不同。

2. 根据抗原物理性状差异或参与的辅助成分的不同，可出现不同的反应，包括：

(1) 凝集反应

(2) 沉淀反应

(3) 中和反应

常称为血清反应。

3. 沉淀反应：毒素等可溶性抗原和相应特异性抗体以合适比例结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应，一般在液体中和半固体琼脂凝胶中反应。

(1) 免疫比浊法：一定量抗体中分别加入相应递增量的可溶性抗原，抗原抗体结合形成数量不等的ic，使反应体系呈现不同的浊度。当抗体含量固定且过剩时，免疫复合物的多少(浊度)可提示抗原浓度，通过自动化浊度仪，可同时检测样品中多种分子并进行精确定量分析。快速、简便，常用于检测转铁蛋白、尿微量蛋白及各种免疫球蛋白和补体

(2) 单向免疫扩散：将已知一定浓度的抗体均匀混合于42-50℃已经熔化的琼脂中，制成凝胶板。隔适当距离打孔，加入被检测可溶性抗原，使其向四周扩散;抗原与琼脂中的抗体相遇，一定时间后，在比例适宜处形成肉眼可见的白色沉淀环，由于沉淀环的直径与抗原浓度相关，可查标准曲线，找出抗原含量，可用于血清中免疫球蛋白g、c3、afp和其他可溶性抗原定量检查。

(3) 双向免疫扩散：在琼脂班上相邻的两孔中分别加入抗原和抗体，使其在琼脂中扩散，两者比例适当时，可在两孔间的适当位置形成白色沉淀线，常用于检测：抗原或抗体的定性;对复杂的抗原或抗体成分进行纯度鉴定;血清免疫球蛋白的效价测定(半定量)。

(4) 免疫电泳：先将待测抗原样品进行琼脂糖凝胶电泳，使不同的组分依据电泳速度不同分散，而后在样品泳道一侧的适当距离处挖一和泳道平行的直线沟槽，在槽内加入已知抗体，让抗体和抗原进行双向免疫扩散，在泳道和槽的中间形成沉淀线，可用于血清蛋白的组分分析，如免疫球蛋白增多疾病的诊断;对流免疫电泳：抗原、抗体同时电泳，中间形成沉淀线。

4. 凝集反应和血型鉴定：颗粒性抗原(细菌、红细胞、偶联抗原的乳胶颗粒)与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，称为凝集抗原

(1) 直接凝集：颗粒性抗原与相应抗体结合后产生的凝集反应 。可鉴定细菌和血型如玻片法为定性试验，常用于菌种鉴定或人类abo血型的鉴定。试管法常用于抗体效价的检测。

(2) 间接凝集：将可溶性抗原或抗体包被在红细胞或乳胶颗粒载体表面后，与相应抗体或抗原作用出现的凝集。颗粒载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒，相应间接凝集现象称为间接血球凝集、间接乳胶凝集，如类风湿因子的检测(人igg吸附在乳胶颗粒)，将已知抗体吸附在载体上的凝集称为反向间接凝集，如rh血型不符检测中对患者抗红细胞rh抗原igg的检测。

(3) 提高灵敏性的办法:已知抗体或抗原标记上酶、荧光素、放射性核素、胶体金等，可进行定量检测，并可检测在组织细胞中的定位和分布。

5. 免疫荧光：用荧光标记的抗体或(抗原)分子检测相对应的抗原或抗体分子的技术。常用的荧光素包括fitc、藻红蛋白(pe)在激发光作用下可分别发绿色或红色荧光，在病原体的诊断、细胞表面cd标志的鉴定等方面用途广泛

(1) 直接荧光法 把荧光素直接标记的抗体与待检细胞或组织切片相互作用，测定未知抗原，用荧光显微镜、流式细胞仪或con-focal进行观察及鉴定

(2) 间接荧光法 将特异性抗体与待测抗原相互作用后，加入荧光素标记的抗一抗抗体，既可检测抗原又可检测抗体。

6. 放射免疫：用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定，同位素的高度敏感性使该方法具有重复性好、准确度高的优点，广泛用于激素等微量物质和ctl功能的检测，敏感性可高达pg/ml的水平,常用的有125i等

7. 酶免疫(elisa和免疫组化)：酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法;将抗原抗体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来，通过酶分解底物产生有色物质(或荧光)，用酶标仪测定光密度值，反应抗原或抗体的含量，常用hrp、alp。

(1) elisa：将抗原或抗体与固相载体(聚苯乙烯)结合，加入待测抗体或抗原，最后以酶标二抗和底物进行检测的技术。简单、快速、特异性强，用于检测抗原和血清抗体效价，最常用

双抗夹心法：检测液相中的可溶性抗原，包被抗体，洗去未吸附抗体，加入待测抗原，37℃1h,抗原与固相抗体结合，洗去未结合抗原，加入酶标二抗，加入底物显色，检测od值地阿姨奥抗原抗体的量和效价

间接elisa：已知抗原包被，加入待检抗体，然后加酶标二抗，洗涤后加底物检测

(2) 免疫组化：应用标记的特异性抗体在组织细胞原位(冰冻或石蜡切片)通过抗原抗体反应和酶-底物的显色反应，用于定位、定性、定量检测组织或细胞中的抗原，具有免疫反应的特异性和组织化学的可见性。

8. 化学发光：用发光物质标记的抗原或抗体检测抗体或抗原的方法，结果用发光光度计检测。具有发光分析高灵敏性，分离简单，自动化分析，发光酶免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光分析

9. 免疫电镜：免疫技术与电镜技术相结合，在超微结构水平观察抗原、抗体结合定位的方法。利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，形成一定电子致密度的复合物，电镜下观察定位。

10. 免疫沉淀：研究蛋白相互作用的经典方法

12. 免疫印迹：(western blotting)

13. 亲和层析：利用分子间专一的亲和力来分离或纯化蛋白质的技术，将亲和对中的一个固定在基质上，制成分离柱，利用分子间亲和的特异性和可逆性，进行分离纯化。

二 免疫细胞分离

常用于包括人外周血单个核细胞(pb-mc)、脾脏淋巴细胞和淋巴结淋巴细胞分离，pb-mc最常用，t、b分离第一步。

1. ficoll-hypaque离心法：

(1) 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法是分离制备pbmc最常用方法;根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度细胞呈梯度分布。

(2) 抗凝血叠加于分离液上，低速离心，细胞分层

rbc：管底;pbmc：血浆层与分离液界面;最上层：血浆，plt悬浮其中;利用单核细胞粘附塑料的特性，可从pbmc中除去

2. 磁珠分离法：利用免疫磁珠(特异性抗体与磁性微粒的交联物)进行特异性淋巴细胞分离的方法;将cd4/cd8等特异性抗体吸附在磁性微珠上，加到细胞悬液中，与具有相应抗原的细胞结合，在置于磁场中，携带有相应细胞的免疫磁珠吸附于靠近磁铁的管壁，即可分离，得到细胞。

3. 流式细胞术：利用荧光活化细胞分析仪(facs)通过细胞表面cd分子的检测而对细胞进行分类和定量的方法;荧光素标记的mab与细胞表面特异cd分子结合，而后将细胞液滴射流经流动室喷嘴以单个细胞喷出，并经高速聚焦激光照射，以激发荧光颜色和强度标识是否具有相应cd分子，可鉴定、分离不同细胞，可单色、双色、多色，进行周期、凋亡分析。

三 免疫细胞的特异性、数量和功能检测

1. 流式细胞术(fcm)：根据表面表达cd分子的种类、水平和多种cd表达格局，以流式细胞术可以二维荧光方图和比例统计显示待测细胞群体中某群cd+细胞的比例及数量、cd分子表达的水平高低，同时以ifnγ等因子或annexinv 凋亡标志,可以测定的功能性ctl、凋亡细胞的比例，以fitc标记靶细胞，通过荧光强度的减弱程度可测定ctl的杀伤活性。

2. 酶免疫斑点试验(elisapot)：功能性细胞(分泌细胞因子)的定量检测;用细胞因子的抗体包被硝酸纤维膜(nc)或聚二氟乙烯(pvdf)覆盖96孔板，加入待检细胞，经抗原特异性刺激后，功能性细胞分泌细胞因子，可被包被的抗体捕获。加抗细胞因子的二抗、生物素-亲和素放大系统、酶及底物显色后，板底分泌相应细胞因子的细胞所在局部产生有色斑点,一个斑点代表一个分泌相应细胞因子的细胞,根据斑点数量判断功能性细胞的数量;根据斑点深浅,判断细胞因子的相对含量。

3. 细胞因子的细胞内染色：功能性细胞的facs定量分析;首先特异性抗原刺激t细胞分泌细胞因子，而后用fitc-cd4染色，同时阻断细胞因子分泌，加入穿膜剂，再加入抗细胞因子单抗(pe标记)，最后facs检测同时激发红、绿色细胞亚群，及分泌相应细胞因子的cd4+t细胞。

4. 抗原肽-mhc分子四聚体法：定量分析抗原特异性ctl的facs新技术;特异性抗原肽、可溶性mhci类分子重链及β2微球蛋白在体外正确折叠，借助生物素-亲和素原理，构建1个荧光素标记的亲和素

（责任编辑：中大编辑）